Purification et caractérisation d'une enzyme coagulante d'origine microbienne pour application en fromagerie

Abstract

L'objectif de notre travail consiste dans un premier temps à isoler des microorganismes provenant de la terre prélevée à proximité d'une laiterie fromagerie située à BOUDOUAOU (Boumerdes -Algérie), le milieu utilisé est le P.C.A, contenant 10% de lait écrémé stérile auquel on a ajouté 2% de l'actidione. Les bactéries sont cultivées dans un milieu contenant 5% de son de blé, 0,3% d'extrait de levure, 0,4% de glucose, 0,2% de caséine et 0,3% d'Na2HPO4. C'est un milieu qui a été adopté dans des travaux précédents pour la culture de Bacillus. L'incubation a lieu à 30°c pendant 24h sous agitation 110 rpm. L'extraction de l'enzyme s'effectue après filtration du milieu sur un tissu pour fromagerie. Le filtrat subit une centrifugation à 4°c pendant 30 minutes à 4200g. Le surnageant est maintenue à basse T° pour le test d'activité. Après avoir testé une soixantaine de souches nous avons sélectionné trois d'entre-elles qui paraissent différentes (I33M, FK6A et P47M), elles ont été identifié par biologie moléculaire. Les résultats du BLAST donnent : I33M : Bacillus mojavensis, P47M : Bacillus subtilis, FK6A: Bacillus amyloliquefaciens. La souche I33M a été sélectionnée par rapport à son activité coagulante très satisfaisante. Nous avons réalisé deux plans d'expériences type composite centré, pour le premier la composition du milieu de production est de : 5% de son, 0,3% d'extrait de levure, 0,3% d'NA2HPO4, 0,05% de glucose, 1,01% de caséine et à T° 39°c. L'agitation est à 200 rpm… Nous pouvons conclure que le glucose n'étant pas significatif. Un deuxième plan nous a donné : 7% de Son, 0 ,094% de caséine, 0,3% d'extrait de levure, 0,3% d'Na2HPO4, la température est de 39°c et l'agitation est de 150 rpm. L'activité coagulante est de 2,18UP.L'activité protéolytique est de 19,302 µgtyr/ml/min. Lors de la fermentation, la croissance est suivie par dénombrement des colonies en milieu PCA après des dilutions successives, puis l'activité coagulante est mesurée. La production de l'enzyme a lieu en fin de phase exponentielle et augmente avec la phase stationnaire. Pour ce qui est des moisissures, la souche sélectionnée a été identifiée comme étant Mucor circinelloides. Un plan statistique (composite centré) a été employé afin d'optimiser les conditions de production de la coagulase par le mucor sélectionné. L'utilisation de la fermentation sur milieu solide contenant : 30gr son de blé, 1gr de caséine, 60ml de sulfate d'ammonium (0,01%) à 30°c pendant 5 jours ont donné une activité maximale de 2,667 UP/ml. La caractérisation de la protéase a révélé des conditions optimales : température d'activité coagulante de 55°c, un pH de 5,5 et une concentration de CaCl2 de 0,03 M