Isolement et caractérisation de microorganismes halophiles à partir d’écosystèmes aquatiques salins et recherche de lipase d’intérêt environnemental et industriel

Abstract

Les lipases halophiles présentent un intérêt industriel en raison de leur grande stabilité, non seulement à des concentrations élevées en sel, mais également à divers égards, tels que la stabilité à haute et basse température et vis-à-vis des solvants organiques. Dans ce travail des approches culturales en combinaison avec des méthodes moléculaires ont été utilisées pour l’isolement et caractérisation de microorganismes halophiles à partir d’écosystèmes aquatiques salins producteurs de lipases, ainsi que leur caractérisation. Une vingtaine de souches archéennes et bactériennes halophiles ont été isolées, purifiées et caractérisées. Les résultats montrent une grande diversité concernant leurs aptitudes biotechnologique à produire des enzymes hydrolytiques, il en ressort que huit souches se sont révélées les plus actives en montrant des activités enzymatiques intéressantes, particulièrement la souche ATS1 qui a affiché le meilleur potentiel de production de lipase, protéase et tannase parmi toutes les souches halophiles étudiées. Cette dernière a été choisi grâce à son large spectre d’activité lypolytique afin d’être investigué pour la production et caractérisation de lipase halophile. La caractérisation biochimique et la séquence du gène ARNr 16S, la souche ATS1 ont été identifiées comme étant un membre des halobacteria, famille des Haloferacaceae. La séquence complète du gène de l'ARNr 16S de la souche ATS1 montrait une similarité de séquence significative à 98% de celle de la souche ATCC 33500T de Haloferax mediterranei. Ces résultats suggèrent fortement que cet isolat peut être attribué à la souche Haloferax mediterranei CNCMM 50101. La caractérisation biochimique la lipase (HML) produite par la souche Haloferax mediterranei CNCMM50101, a montré que l’optimum de production de l’enzyme lipase est obtenu avec 50 U/mL après 72 heures d’incubation à 150 rpm avec 5% d’inoculum, 15% NaCl, pH 7, 40°C, 0,1% d’extrait de levure comme source d’azote et l'huile d’olive et amidon comme inducteur et source de carbone. La caractérisation de l’extrait lipolytique pure montre que le pH optimum est de 7 et la température optimale est de 60°C. Le calcium à 2 mM améliore considérablement la thermoactivité et la thermostabilité de l’enzyme. Cette Archée halophile extrême produit une seule lipase monomérique de masse moléculaire environ 45 kDa déterminée par SDS-PAGE et confirmée par l'analyse spectrométrie de masse (MALDI-TOF / MS), avec une masse moléculaire de 45 011,09 Da. La HML a montré une activité spécifique plus élevée sur les triacylglycérols avec les acides gras à longues chaînes, ce qui indique que la HML est une vraie lipase. Cette enzyme était complètement inhibée par PMSF et DFP, suggérant qu'elle appartenait à la famille des lipases à sérine. HML a montré une tolérance élevée aux solvants organiques, une stabilité exceptionnelle en présence des agents de surface, agents oxydants et auxiliaires ainsi qu’une compatibilité considérable avec divers détergents commerciaux liquides et solides. L’ajout de la lipase HML à la solution détergente améliore les performances du détergent iSiS dans le sens d’une meilleure élimination des tâches d’huile. La lipase HML de Haloferax mediterranei CNCMM50101 semble être intéressante et pourrait être utilisée dans des applications biotechnologiques comme additif biologique dans les détergents liquides et solides et biocatalyseur en synthèse peptidique. Le suivi du traitement biologique des margines à 50% par Haloferax mediterranei CNCMM50101 durant un mois a permis de constater l’existence d’une corrélation entre l’abattement de la DCO et celui des composés phénoliques avec un coefficient de corrélation très significative de 0,99. Ainsi, qu’entre la réduction des AG libres et la DCO avec un coefficient de corrélation de 0,98. Ceci nous laisse déduire que la production de la biomasse provient en grande partie des produits de la dégradation des composés phénoliques et lipidiques. L’étude préliminaire de la production de l’enzyme lipase et tannase par Haloferax mediterranei CNCMM50101 en utilisant les margines à 50% comme milieu de culture a donné des résultats encourageants. Cette production d’enzyme lipase et tannase est accompagnée par des taux d’abattement des composés phénoliques avec des taux de 83,55%, et de 53, 93% d’acides gras libres. L’augmentation des taux de réduction de ces composés organiques est accompagnée par la réduction de la DCO qui atteint 94,18% au 28ème jour. Ainsi, Haloferax mediterranei CNCMM50101 est donc capable à la fois de traiter les margines à 50% et de produire des activités enzymatiques de type lipase et tannase qui présentent une haute valeur industrielle. Ainsi cet effluent ne peut être considéré comme source préjudice pour l’environnement mais un milieu de culture stable est facilement exploitable