Optimisation de la production de protéases par une souche fongique locale (Rhizopus, Mucor) : purification, caractérisation et aptitude à la fabrication fromagère

Abstract

Les protéases aspartiques produites par différentes moisissures non pathogènes, appartenant à l'ordre Mucorales, sont couramment utilisées dans l'industrie laitière en tant qu'agents coagulant le lait. L'objectif de notre travail cible la recherche des nouvelles souches fongiques locales produisant des protéases coagulant le lait afin d'être appliquées dans la fabrication du fromage. La plupart des souches isolées à partir des sols agricoles (centre d'Algérie) ont été capables de produire des extraits enzymatiques avec des temps de coagulation entre 2 et 17 min. La souche la plus performante, identifiée comme étant Mucor circinelloides (von Thieghem) MG603064, a été sélectionnée pour optimiser la production par fermentation sur milieu solide, via la méthode classique "un seul facteur à la fois". L'activité coagulante maximale de 571,43 US/mL a été obtenue en utilisant 10 g du son de blé comme la source principale de carbone, contenant 1% (p/p) de galactose, humidifié avec la solution minérale M-9 (pH 6,0) et incubé à 30°C pendant 96 h.Le plan Plackett?Burman à deux niveaux a été appliqué afin de sélectionner les facteurs améliorant de manière significative la production de la protéase coagulante. Le milieu de production a été préparé sur la base des résultats préliminaires. L'analyse statistique de la réponse (activité coagulante) a révélé que les facteurs contributifs sont: la température de fermentation, le pH de milieu, le temps d'incubation et le niveau d'humidité. Les autres facteurs testés (taille d'inoculum, (NH4)2SO4, galactose) ont été exclus de l'étude. Le plan a montré qu'un milieu contenant 0,1 g de (NH4)2SO4, humidifié à un taux de 50,1%, inoculé avec 1 mL de la suspension de spores (12,6×107 spores/mL) et incubé à 25°C pendant 96 h, était optimal pour la production de la protéase avec une activité coagulante de 888,9 US/mL. Une augmentation de la production par un facteur de 1,69 a été notée suite à l'application du plan composite centré pour atteindre un maximum de 1500 US/mL, obtenu par fermentation à 25°C avec un taux d'humidité de 56,1% et un pH de 4,23 mais après 72 h d'incubation. La purification de l'enzyme, par fractionnement au (NH4)2SO4 solide à 20?70% de saturation suivie d'une chromatographie d'exclusion moléculaire sur Sephadex G-100, a permis d'obtenir une protéase purifiée 20 fois avec un rendement de 18,41%. L'activité optimale de la protéase purifiée a été obtenue à pH 5, une température de 60°C et en présence de CaCl2 à 25 mM. La protéase est stable dans l'intervalle de pH 3?4,5 pendant 24 h à 4°C dans le tampon citrate (0,1 M) et conserve plus de 80% de son activité maximale à 45°C pendant 1 h, avec une inactivation complète à 70?75°C. L'inhibition de l'activité coagulante obtenue en présence de 0,1 mM de Pepstatine A (98,6%) confirme que l'enzyme est une protéase à acide aspartique. L'activité coagulante a été significativement améliorée par 40,5 ; 59,5 ; 75,6 et 85% en présence des ions Mg2+, Fe2+, Mn2+ et Zn2+, respectivement, et fortement inhibée par Al3+ (93,1%) et Hg2+ (94,4%) à une concentration de 10 mM. La stimulation maximale d'activité de 120% a été révélée en présence de Ba2+ en utilisant la même concentration. Les extraits bruts et pré-purifiés ont été appliqués dans des essais de fabrication de fromages à pâte molle type Camembert et semi-dure type Edam, en tant que des substituants possibles pour la présure animale par comparaison à deux coagulants commerciaux. Les propriétés physicochimiques des fromages produits étaient très proches. Une faible qualité sensorielle des fromages a été obtenue avec l'extrait brut, dans les deux cas de fabrication, qui a été améliorée avec l'utilisation de la protéase pré-purifiée pour atteindre celle donnée par la présure commerciale dans le cas du fromage Camembert. Les résultats obtenus durant les essais de fabrication du fromage sont très satisfaisants, ce qui permet de prédire que le coagulant purifié de M. circinelloides peut être considéré comme un nouveau succédané de la chymosine bovine. Afin d'atteindre cet objectif, la présente étude doit être complétée par des étapes d'optimisation et de purification supplémentaires pour augmenter l'activité enzymatique de la protéase pure et son application dans la production de différentes variétés du fromage