Optimisation de la production de la protéase de Rhizopus stolonifer sur milieu solide : purification et caractérisation

Abstract

Le but de cette présente investigation est la production, la purification et l’étude de certaines propriétés de la protéase de Rhizopus stolonifer en vue de son utilisation dans la coagulation du lait. L’étude de l’influence de certains paramètres sur le taux de production de la protéase a été réalisée. Il a été constaté que la température optimale de production de la protéase de Rhizopus stolonifer est de 28 °C, son pH optimum est de 6, la taille optimale de l’inoculum est de 2 x 106 spores /ml, le taux d’humidité optimal du son de blé est de 50.6%, la quantité du son de blé optimale est de 10 g et le temps d’incubation optimale est de 96 heures. L’addition de certaines sources de carbone et d’azote au son de blé pour l’amélioration de l’activité coagulante de notre protéase, nous a permis de noter que la meilleure source de carbone et d’azote sont le galactose { 10% et la peptone { 1% respectivement. La purification de la protéase par précipitation au sulfate d‘ammonium à 80% suivie d’une chromatographie par filtration sur gel sephadex G100 a permis de déceler un rendement en activité de la protéase de 9.25%, un facteur de purification de 19.2 avec une activité spécifique de 2850,7 U/mg et un poids moléculaire de 41.4 ± 1.00 kDa. La vérification de l’homogénéité de la protéase de R. stolonifer par électrophorèse en conditions dénaturante a révélée un poids moléculaire de 42.96 ± 1.00 kDa. La caractérisation de la protéase de R. stolonifer a révélé que sa température optimale d’activité coagulante est de 50°C et que sa stabilité est notée aux températures 30 à 45°C. Son pH optimum est de 5.5 et que l’extrait purifié est stable pendant 24 h { 4 °C dans le tampon citrate phosphate. L’étude de l’effet de la concentration en extrait purifié et en chlorure de calcium sur l’activité coagulante de la protéase de R. stolonifer montre que l’augmentation de son activité coagulante est proportionnelle à leurs concentrations respectives. L’extrait purifié de R. stolonifer préserve mieux son activité coagulante au cours de la conservation par congélation à -18°C comparativement à la réfrigération à 4°C. L’inhibition de l’activité coagulante de l’extrait purifié par la pepstatin A à 71%, nous oriente vers la possibilité de la présence d’un groupement aspartyl dans le site actif de la protéase de R. stolonifer